微生物測定--菌落總數(shù)測定經(jīng)驗(yàn)分享

1．菌落總數(shù)的測定。是以檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞和營養(yǎng)瓊脂混合后，每個細(xì)菌細(xì)胞都能形成一個可見的單獨(dú)菌落的假定為基礎(chǔ)的。由于檢驗(yàn)中采用36℃于有氧條件下培養(yǎng)(空氣中含氧約20％)，因而并不能測出每g或mL檢樣中實(shí)際的總活菌數(shù)，厭氧菌、微嗜氧菌和嗜冷菌在此條件下不生長，有特殊營養(yǎng)要求的一些細(xì)菌也受到了限制，因此所得結(jié)果，只包括一群能在普通營養(yǎng)瓊脂中發(fā)育、嗜中溫的、需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落的總數(shù)。

 

2．鑒于食品檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞是以單個，成雙、鏈狀、葡萄狀成堆的形式存在，因而在營養(yǎng)瓊脂平板上出現(xiàn)的菌落可以來源于細(xì)胞塊，也可以來源于單個細(xì)胞，因此平板上所得需氧和兼性厭氧菌菌落的數(shù)字不應(yīng)報告活菌數(shù)，而應(yīng)以單位重量、容量或表面積內(nèi)的菌落數(shù)或菌落形成單位數(shù)(colony forming units，CFU)報告之。

 

3．每種細(xì)菌都有它一定的生理特性，培養(yǎng)時，應(yīng)用不同的營養(yǎng)條件及其他生理條件(如溫度、培養(yǎng)時間、pH、需氧性質(zhì)等)去滿足其要求，才能分別將各種細(xì)菌都培養(yǎng)出來。因此，要得到較全面的細(xì)菌菌落總數(shù)，應(yīng)將檢樣接種到幾種不同的非選擇性培養(yǎng)基上，并培養(yǎng)在不同條件下，如溫度，氧氣供應(yīng)等。但國家頒發(fā)的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)對不同食品的菌落總數(shù)的規(guī)定，都是根據(jù)用普通營養(yǎng)瓊脂進(jìn)行需氧培養(yǎng)所得的結(jié)果確定的，因此在食品的一般衛(wèi)生學(xué)評價中并不要用幾種不同的非選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。

測定食品中菌落總數(shù)時，是將食品檢樣做成幾個不同的10倍遞增稀釋液，然后從各個稀釋液中分別取出一定量在平皿內(nèi)與營養(yǎng)瓊脂相混合，經(jīng)培養(yǎng)后，按一定要求計算出皿內(nèi)瓊脂平板上所生成的細(xì)菌集落數(shù)，并再根據(jù)檢樣的稀釋倍數(shù)，計算出每g或mL樣品中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。

為了正確地反映食品中各種需氧和兼性厭氧菌存在的情況，檢驗(yàn)時必須遵循以下一些要求和規(guī)定。

 

1．檢驗(yàn)中所用玻璃器皿，如培養(yǎng)皿，吸管、試管等必須是*滅菌的，并在滅菌前*洗滌干凈，不得殘留有抑菌物質(zhì)。

2．用作樣品稀釋的液體，每批都要有空白對照。如果在瓊脂對照平板上出現(xiàn)幾個菌落時，要追加對照平板，以判定是空白稀釋液，用于傾注平皿的培養(yǎng)基，還是平皿吸管或空氣可能存在的污染。

3．檢樣的稀釋液雖可用滅菌鹽水或蒸餾水，但以用磷酸緩沖鹽水特別是0.1％蛋白胨水為合適，因蛋白胨水對細(xì)菌細(xì)胞有更好的保護(hù)作用，不會因?yàn)樵谙♂屵^程中而使食品檢樣中原已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)致死亡。如果對含鹽量較高的食品(如醬品等)進(jìn)行稀釋，則宜采用蒸餾水。

 

1．檢樣稀釋時，應(yīng)以無菌稱取(或量取)有代表性的液體樣品25g(或mL)剪碎放于含有225mL滅菌稀釋液的玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖作成1:10的稀釋液。

如系肉、魚等固體樣品，最好剪細(xì)于無菌均質(zhì)袋與稀釋液拍擊均勻，或與稀釋液同置于滅菌均質(zhì)器杯中，以8000~l 0000rpm速度攪拌1分鐘，使做成均勻的1:10稀釋液。

 

2．根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，將上述1:10的檢樣稀釋液再做成幾個適當(dāng)?shù)?0倍遞增稀釋液。即取1:10稀釋液1mL與9mL稀釋液混和做成1:100的稀釋液，然后依次遞增稀釋，做成1:1000、1:10000等稀釋液。注意每遞增稀釋一次，必須另換1支1mL滅菌吸管，這樣所得檢樣的稀釋倍數(shù)方為準(zhǔn)確。

 

3．從吸管筒內(nèi)取出滅菌吸管時，不要將吸管尖碰著其他仍留在容器內(nèi)的吸管的外露部分；而且吸管在進(jìn)出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時，也不要觸及瓶口及試管口的外側(cè)部分；因?yàn)檫@些部分都可能接觸過手或其他沾污物。

 

4．在作10倍遞增稀釋中，吸管插入檢樣稀釋液內(nèi)不能低于液面2.5cm；吸入液體時，應(yīng)先高于吸管刻度，然后提起吸管尖離開液面，將尖貼于玻璃瓶或試管的內(nèi)壁使吸。管內(nèi)液體調(diào)至所要求的刻度，這樣取樣較準(zhǔn)確，而且在吸管從稀釋液內(nèi)取出時不會有多余的液體粘附于管外。

5．當(dāng)用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9mL空白稀釋液的試管內(nèi)時，應(yīng)小心沿管壁加入，不要觸及管內(nèi)稀釋液，以防吸管尖外側(cè)部分粘附的檢液也混入其中。

 

1．將稀釋液加至滅菌平皿內(nèi)時，應(yīng)根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，選擇2~3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移lmL稀釋液加入皿內(nèi)(從皿側(cè)加入，不要揭去皿蓋)，最后將吸管直立使液體流畢，并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出，而不要吹出。每個稀釋度應(yīng)作2個平皿。

 

2．用于傾注平皿的營養(yǎng)瓊脂應(yīng)預(yù)先加熱使其融化,并保溫于(45±1)℃恒溫水浴中待用。溫度太高影響細(xì)菌生長,太低瓊脂易凝固不能與檢液充分混勻, 傾注平皿時,每皿內(nèi)傾入約15mL,平板過厚可影響觀察,太薄又易干裂,最后將瓊脂底部帶有沉淀的部分棄去。

※為了防止細(xì)菌增殖及產(chǎn)生片狀菌落,在檢液加入平皿后,應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻,可正反兩個方向旋轉(zhuǎn),以使充分混勻。旋轉(zhuǎn)中應(yīng)加小心，不要使混和物濺到皿邊的上方。檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min。瓊脂凝固后,在數(shù)分鐘內(nèi)即應(yīng)將平皿翻轉(zhuǎn)予以培養(yǎng),這樣可避免菌落蔓延生長。

3.為了控制污染,需做空白對照實(shí)驗(yàn),在取樣進(jìn)行檢驗(yàn)的同時,于工作臺上打開一塊瓊脂平板,其暴露的時間,應(yīng)與該檢樣從制備、稀釋到加入平皿時所暴露的最長的時間相當(dāng),然后與加有檢樣的平皿一并置于溫箱內(nèi)培養(yǎng),以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過程中有無受到來自空氣的污染。

4．皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要長久放置，然后始翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)；易于瓊脂凝固后，在數(shù)分鐘內(nèi)即應(yīng)將平皿翻轉(zhuǎn)予以培養(yǎng)，這樣可避免菌落蔓延生長。必要時，可先將皿打開倒置(皿底向上)于溫箱內(nèi)經(jīng)15~60分鐘使瓊脂表面干燥后，再將皿底移至蓋內(nèi)倒置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)。這樣可以阻止運(yùn)動性強(qiáng)的變形桿菌屬、假單胞菌屬和芽胞桿菌屬中一些菌株在瓊脂表面擴(kuò)展生長。

 

5．為了控制污染，在取樣進(jìn)行檢驗(yàn)的同時，于工作臺上打開一塊瓊脂平板，其暴露的時間，應(yīng)與該檢樣從制備、稀釋到加入平皿時所暴露的最長的時間相當(dāng)，然后與加有檢樣的平皿一并置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)，以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過程中有無受到來自空氣的污染。

 

6．培養(yǎng)溫度，應(yīng)根據(jù)食品種類而定。肉、，乳、蛋類食品用36℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48±2小時。水產(chǎn)品用30℃培養(yǎng),培養(yǎng)時間為72±2小時。培養(yǎng)溫度和時間之所以有這種不同的區(qū)分，乃是因?yàn)樵谥贫ㄟ@些食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于菌落總數(shù)的規(guī)定時，分別采用了不同的溫度和培養(yǎng)時間所取得的數(shù)據(jù)之故。水產(chǎn)品因來自淡水或海水，水底溫度較低，因而制定水產(chǎn)品細(xì)菌方面的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時，系用30℃作為培養(yǎng)的溫度。

1．加入平皿內(nèi)的檢樣稀釋液(特別是10^-1的稀釋液)，有時帶有食品顆粒，在這種情況下，為了避免與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液與瓊脂混和的平皿，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境中放置，以便在計數(shù)撿樣菌落時用作對照。

 

2．為了防止檢樣中食品顆粒與菌落混淆，也可在已溶化而保溫于45℃水浴內(nèi)的瓊脂中，按每100mL加lmL0.5％氯化三苯四氮唑(2，3，5triphenyltetrazolium chloride，TTC)水溶液之量加入適量的TTC。培養(yǎng)后，如系食品顆粒，不見變化。如為細(xì)菌，則生成紅色菌落。配好的TTC溶液，應(yīng)先用來與不加TTC的作對照，以觀察其對計數(shù)是否有不利的作用(TTC在一定濃度下對革蘭氏陽性菌有抑制作用)。TTC溶液要放冷暗處保存，以防受熱與光照而發(fā)生分解。無色的TTC是作為受氫體加入培養(yǎng)基中，如果有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后，在細(xì)菌脫氫酶的作用下，TTC便接受氫而成為紅色的三苯基甲艏(formazan)，使菌落呈現(xiàn)紅色。

1．從溫箱內(nèi)取出平皿進(jìn)行菌落計數(shù)時，應(yīng)先分別觀察同一稀釋度的兩個平皿和不同稀釋度的幾個平皿內(nèi)平板上菌落生長情況。平行試驗(yàn)的2個平板與菌落數(shù)應(yīng)該接近，不同稀釋度的幾個平板上菌落數(shù)則應(yīng)與檢樣稀釋倍數(shù)成反比，即檢樣稀釋倍數(shù)越大，菌落數(shù)越低，稀釋倍數(shù)越小，菌落數(shù)越高。

 

2．計數(shù)菌落時，應(yīng)選取菌落數(shù)在30~300之間的平板作為菌落總數(shù)測定的標(biāo)準(zhǔn)。一個稀釋度使用兩個平板，應(yīng)采用兩個平板平均數(shù)；如其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。如在一個稀釋度的兩個平板中，一個平板的菌落數(shù)在30一300之間，另一個大于300或小于30時，則以菌落數(shù)在30—300間的平板作為計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。

 

3．菌落計數(shù)所得結(jié)果，可分別按以下幾種不同情況作報告：

 

a、若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi),計算兩個平板菌落數(shù)的平均值,再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),作為每 g ( mL )樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。

b、若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時,按式( 1 )計算:

示例:

c、若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU ,則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數(shù),其他平板可記錄為多不可計,結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。

d、若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU ,則應(yīng)按稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。

e、若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于 1 乘以稀釋倍數(shù)計算。

d、若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU~300CFU之間,其中一部分小于30CFU或大于300CFU時,則以接近30CFU或 300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。

(1)如果稀釋度大的平板上菌落數(shù)反比稀釋度小的平板上菌落數(shù)高，則系檢驗(yàn)工作中發(fā)生的差錯，屬實(shí)驗(yàn)室事故。此外，也可能因抑菌劑混入樣品中所致，均不可用作檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。

 

(2)如果平板上出現(xiàn)鏈狀菌落，菌落之間沒有明顯的界限，這是在瓊脂與檢樣混合時，一個細(xì)菌塊被分散所造成。一條鏈作為一個菌落計，如有來源不同的幾條鏈，每條鏈作為一個菌落計，不要把鏈上生長的各個菌落分開來數(shù)。

 

(3)如果所有平板上都有菌落密布，不要用多不可計作報告，而應(yīng)在稀釋度最大的平板上，任意數(shù)其中2cm²個，除2求出每cm²內(nèi)平均菌落數(shù)乘以皿底面積63.6cm²數(shù)，再乘其稀釋倍數(shù)作報告。如所用平皿的皿底直徑不是9cm，則可按其直徑的實(shí)際cm數(shù)代人圓面積公式求出。

 

(4)檢樣如系微生物類制劑(如酸牛乳、酵母制酸性飲料)，則平板計數(shù)中應(yīng)相應(yīng)地將有關(guān)微生物(乳酸桿菌、酵母菌)排除，不可并入檢樣的菌落總數(shù)內(nèi)作報告。一般在校正檢樣的pH7.6后，再進(jìn)行稀釋和培養(yǎng)，此類嗜酸性微生物往往即不易生長。并可用革蘭氏法染色鑒別。染色鑒別時，要用不校正pH的檢樣做成相同稀釋度的稀釋液培養(yǎng)所生成的菌落涂片染色作對照，以資辨別。酵母菌卵圓形，遠(yuǎn)比細(xì)菌大，大小為2～5×5～30μm，革蘭氏陽性著色。乳酸桿菌在24小時內(nèi)，于普通營養(yǎng)瓊脂平板上在有氧條件下培養(yǎng)，通常是不生長的。

1、菌落數(shù)小于100CFU時,按“四舍五入"原則修約,以實(shí)有數(shù)報告。

2、菌落數(shù)大于或等于100CFU時,第3位數(shù)字采用“四舍五入"原則修約后,取前2位數(shù)字,后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來表示,按“四舍五入"原則修約后,采用兩位有效數(shù)字。

 

3、若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù),則報告菌落蔓延。

 

4、 若空白對照上有菌落生長,則此次檢測結(jié)果無效。

 

5、稱重取樣以CFU/g為單位報告,體積取樣以CFU/mL為單位報告。

a、檢樣為固體，用重量法取樣檢驗(yàn)時，以g為單位報告其菌落數(shù)；檢樣為液體，用容量法取樣檢驗(yàn)時，以mL為單位報告其菌落數(shù)；如檢樣為樣品表面的涂擦液，則應(yīng)以cm2為單位報告其菌落數(shù)。

b、如檢樣為液體，在兩個平皿內(nèi)所加lmL未經(jīng)稀釋的檢樣(原液)培養(yǎng)中，均無細(xì)菌集落生成，則報告為lmL檢樣內(nèi)未有菌落生長，或1mL檢樣內(nèi)菌落數(shù)<1。